【Inscopix应用】Cell：记忆形成与提取的神经环路

多年以来，科学界普遍认为记忆的形成与提取是由一类神经元——印迹细胞（engram cells）的激活与抑制而实现。其中，包含海马和内嗅皮层（EC）的颞叶系统在情境记忆过程当中起至关重要的作用。然而大家对海马区域中的一个亚区——海马下托（Subiculum, Sub）的功能鲜有了解（图1）。

图1 小鼠的背侧海马区域[1]

在哺乳动物当中，记忆的信息整合十分曲折。从内嗅皮层的表层传递到齿状回（dentate gyrus， DG）的记忆信息受到海马CA亚区（CA3， CA2和CA1）的调控。背侧海马CA1亚区即有对内嗅皮层第5层亚区(EC5)的直接投射，也有经由背侧海马下托（dSub）的间接投射。更令人感兴趣的是，dSub亚区不仅仅投射到EC5，也会投射到很多皮层及皮层下脑区（图2）。其中的复杂纷乱，可见一斑。

图2 海马体的输入与输出[2]

在Cell杂志最近发表的一项研究中，Dheeraj S. Roy等人构建出一种转基因小鼠（FN1-Cre mice），它们只在dSub脑区的神经元内表达Cre重组酶。通过神经元环路示踪以及光遗传学方法，他们发现dSub的投射在记忆的形成与提取过程当中扮演不同角色，这与过去的假设大相径庭。记忆的提取需主要被CA1经由dSub到EC5这条环路调控，而记忆的形成则需要CA1到EC5的直接投射，这条直接环路并不调节记忆提取，即回忆过程（图3）。

图3 海马、内嗅皮层环路对记忆形成与提取的调控

那么，如何研究不同神经环路在不同记忆过程中的作用呢？

首先，他们使用神经元特异性示踪的方法，研究了dSub脑区上下游的投射规律（图4）。其次，他们通过光遗传学手段，人工激活或抑制不同神经环路，得出，dSub脑区的不同投射调控记忆提取以及回忆引起的应激反应；CA1到EC5的直接投射调控记忆的形成而不是提取过程。最后，他们应用Inscopix nVista自由活动钙成像技术，通过钙成像方法，研究CA1和dSub脑区活性在小鼠训练和回忆过程中的变化。最后的过程至关重要，因为光遗传学方法加入了人为操作过程，而钙成像方法令小鼠不受任何干扰，直接体现出神经元的活性变化。当钙指示剂荧光上升时，我们认为反映了细胞或者脑区的活性上升。

现阶段，钙成像的技术有光纤钙成像记录，双光子钙成像记录和神经元超微钙离子成像技术。光纤成像技术可以做到细胞特异性记录，但是信号反应的是脑区细胞群体钙信号的变化，无法精确到单细胞水平；双光子成像技术可以做到细胞特异性，同时精确到细胞水平，但现阶段只能应用在皮层，主要受限于双光子的有效工作距离（数百微米）；而自由活动钙成像技术可以同时具有可应用于深部脑区，细胞特异性，单细胞水平记录这几大优势。

图4 dSub脑区的逆向示踪结果

首先，他们将Cre依赖的GCaMP6f病毒注射在FN1-Cre和WFS1-Cre小鼠的右侧海马中。1个月后，在背侧dSub脑区或者CA1脑区背侧埋植直径约1mm的GRIN Lens。再过1个月后，将nVista自由活动钙显微成像系统安装在埋植好的GRIN Lens之上，小鼠需要适应实验环境以及GRIN Lens装置2周时间。

一系列的准备之后，他们便开始dSub脑区或CA1脑区钙信号的采集。在旷场（open field）行为学范式中，CA1脑区展现出均一性激活方式，而dSub脑区则表现为2种不同激活方式共存，一种是和CA1脑区类似的short-tail方式，另一种是持续激活长达15s的long-tail方式（图5）。

图5 dSub脑区或CA1脑区的钙信号采集图示

功能方面，dSub神经元展现出更宽的位置野（place field）,即在旷场实验中，dSub神经元会比CA1神经元在更多的位置激活（图6）。

图6 CA1脑区和dSub脑区的位置野钙信号以及热图

对于条件化恐惧（contextual fear conditioning）行为学范式，在训练过程和回忆过程中，小鼠CA1脑区被激活的的神经元比例均有提高，而小鼠dSub脑区的神经元则特异性的在回忆过程中被激活。为了排除运动带来的影响，他们又将训练、回忆过程细分为非恐惧时期（NF）和恐惧时期（F）。CA1脑区的钙信号在训练时的恐惧时期显著性强于非恐惧时期，而在回忆阶段2者并无差异。而dSub脑区的钙信号只是在回忆阶段显著性的提升，并不受恐惧、非恐惧时期的影响，真正被恐惧回忆所激活的是dSub脑区中的long-tail神经元（图7）。这一部分结果与前文cfos信号的结果一致，并阐明了CA1脑区和dSub脑区在记忆形成与提取过程中的不同作用。

图7 在条件化恐惧行为学范式中的钙信号活性

总结这篇文章，我们知道海马内嗅皮层神经元以及它们之间的环路如何调控记忆的形成以及记忆的提取过程。文章使用神经元示踪技术、光遗传学技术比较熟悉，而现在刚刚流行的Inscopix nVista自由活动钙成像技术正是文章的亮点之一。

参考文献：

1. Roy,D.S., et al., Distinct Neural Circuits forthe Formation and Retrieval of Episodic Memories. Cell, 2017. 170(5): p. 1000-1012 e19.

2. Zhang, X.M. and J. Zhu, Kainic Acid-induced neurotoxicity: targetingglial responses and glia-derived cytokines. Curr Neuropharmacol, 2011. 9(2): p. 388-98.

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