【Inscopix应用】Science：杏仁核神经元编码行为状态的机制

杏仁核神经元编码行为状态的机制

大脑的“内在状态”驱动了我们的行为，比如在焦虑、压力或口渴的状态下会强雷的影响和激励我们的行为。目前，我们对于这种“内在状态”是如何通过复杂的脑神经环路（含杏仁核等皮层下结构）来表示的，还不太清楚。

在一项新的研究中，来自巴塞尔大学的Andreas Lüthi教授团队发现在小鼠基底外侧杏仁核中两类主要的、相互不重叠的投射神经元亚群活动水平的相对变化，它们编码了预期探索性、非探索性和防御状态之间的行为转变。此外，科研人员还发现了杏仁核对外部刺激和内部状态的分别编码，并通过几个输出通路想大脑神经网络发送信息。这项研究的成果发表在2019年4月19日的Science上，论文标题为“Amygdala ensembles encode behavioral states“。该论文通过使用美国Inscopix公司的nVista自由活动钙成像技术监测了小鼠在三种连续且不同的行为范式（旷场实验、高架十字迷宫和巴普洛夫恐惧条件反射实验）中基底杏仁核（the basal amygdala，BA）投射神经元的发放情况，发现不同的环境促使小鼠出现了不同的内部状态和行为，这些信息可能与大脑状态的不同方面有关，包括焦虑、觉醒、感觉处理和行为选择。

图1 杏仁核编码行为状态

文章简读

当一只老鼠饥饿的时候，它会去觅食；当它焦虑的时候，它会停止探索它的环境，并且表现出冻结或逃避行为。尽管科研人员做了很详细的研究，但是这些内部状态是如何与动物的行为相关联的，大脑是如何编码和控制内部状态还是知之甚少。

Lüthi小组的研究员、巴塞尔大学的Jan Gründemann教授，与同为Lüthi小组的博士后，计算神经学家Yael Betterman一起研究了不同状态下自由运动小鼠杏仁核的神经元活动。

图2 自由活动动物的基底杏仁核神经元的深部脑成像

首先，研究人员在小鼠基底杏仁核中注射了AAV-CaMKII-GCaMP6f，并植入自聚焦透镜（GRIN Lens），在颅骨上连接美国Inscopix公司的nVista自由活动钙成像系统观察在三种连续且不同的行为学范式（旷场实验、高架十字迷宫和巴普洛夫恐惧条件反射实验）中自由活动的小鼠BA神经元Ca2+荧光变化情况（图3A，B）。

在旷场实验中（the open-field, OF），小鼠的趋避特性让其进入新环境后主要在外围区域活动，而小鼠的探索特性又促使其产生在中央区域活动的行为（图3C，D）。作者通过美国Inscopix公司的nVista自由活动钙成像技术观察了在OF探索过程中小鼠BA -CaMKII阳性神经元的活动情况，发现，BA神经元表现出不同的活动模式，如图3H，I中列出了4个神经元显示了非特异性（细胞114和100）和区域调控（细胞40和61）模式。

图3 自由活动小鼠在探索过程中BA区的神经元钙成像

随后，科研人员根据小鼠位于角落和中央区域时神经元Ca2+活性的差异对神经元面积分数进行分析，并设定了区域调控的阈值（图4A,B）。结果发现，在整个BA神经元群中，角落调控神经元（绿色）和中央调控神经元（橙色）在比例上是相似的，且在空间上呈混杂分布，没有明显的局部聚集（图4C,D）。

他们进一步研究了小鼠在中央区域和角落区域过渡期间的神经元反应，发现当小鼠进入或离开角落区域时，BA中一大群神经元要么被激活（ensemble1），要么被抑制（ensemble2）。通常情况下，ensemble1细胞在进入角落区域时被激活，并与角落调控细胞重叠，而ensemble2细胞在离开角落区域时被激活，并与中央调控细胞相对应（图4F-I）。

图4 大量的BA神经元群在空间上受到调控

接下来，为了研究上述BA神经元群编码的原则是否在不同情境下的探索行为也有相似的结果，科研人员在高架十字迷宫（elevated plus maze, EPM）实验中对上述相同的BA投射神经元进行了美国Inscopix公司的nVista自由活动钙成像观察（图3B,5B）。他们假设BA投射神经元的区域调制特征在高架十字迷宫中也有类似的现象，即角落调制细胞在小鼠停留于高架十字迷宫封闭臂中时可能更活跃，而中央调制细胞在开放臂探索时可能表现出更高的活动水平。

在高架十字迷宫实验中，小鼠的嗜暗天性使其在封闭臂中活动，然而小鼠探究新环境的习性又促使其离开封闭臂进入开放臂，此外，小鼠还进行了探头行为，即在EPM开臂的边缘进行短暂的视觉观察（图3E,F）。美国Inscopix公司的nVista自由活动钙成像技术观察发现，角落调控细胞的平均活性在小鼠位于封闭臂中降低；中央调控细胞的活性则增加。然而，一旦小鼠离开封闭臂进行探索行为，角落调控细胞和中央调控细胞的活性水平发生逆转，即角落调控细胞Ca2+荧光强度增加，中央调控细胞Ca2+荧光强度降低。（图5B-F）。这表明角落调控细胞的活性与高架十字迷宫实验中小鼠在封闭臂和开放臂中的探索行为有关。

为进一步验证这一观点，他们分析了小鼠在开放臂边缘的探头行为（一种典型的探索性低焦虑行为）时角落调控细胞和中央调控细胞的活动。结果发现，小鼠进行探头行为时，角落调控细胞被强烈的激活，而中央调控细胞被抑制（图5G-I）。

图5 调控高架十字迷宫的角落和中央的细胞编码探索行为

进一步，科研人员对行为状态之间的转变在神经元群体上的编码情况进行分析，首先，他们按旷场行为学实验中将神经元群体进行分类（图6A，44G），随后，他们分析了这三个集合在不同行为改变上的活动情况，发现，ensemble1神经元编码与探索性相关的行为状态，ensemble1神经元不仅仅在旷场实验中小鼠进入角落区域被激活，也在高架十字迷宫实验中小鼠在进行开臂边缘探头行为时被激活，而ensemble2神经元则表现出相反的活动调节模式。此外，对单个神经元的响应进行分析，发现了类似的结果（图6）。

图6 BA神经元群正交编码行为状态和感觉刺激

最后，科研人员对BA神经元中编码行为状态的群体与编码感官刺激的群体之间的关系展开研究。他们采用经典的巴浦洛夫恐惧条件反射实验行为学范式（图7A），发现非条件刺激（US）响应的本身不与任何被测试的行为状态有关，即US特征与特定的行为状态没有联系（图7C）。在恐惧条件反射实验后，条件刺激CS+-响应神经元与恐惧消退启动抑制的神经元具有较多的重叠，这些神经元通常是通过探索性行为进行激活的（类似于ensemble1），而与恐惧消退启动抑制的神经元重叠较少（图5）。

图7 感官刺激和行为状态的正交表示

Lüthi说：“这项研究的力量在于，我们能够直接询问大脑中老鼠所处的情感状态。”“如果我们想要理解一种行为，我们就需要了解大脑！仅仅根据标准化的行为观察得出结论可能会误导我们。”作为下一步，Lüthi小组希望更多地了解这些活跃的细胞是如何在杏仁核中产生的，以及它们如何影响大脑中的其他区域。

这些发现与人类焦虑症有关吗？Lüthi说：“内部状态的编码——比如焦虑——在人类身上可能以类似的方式在老鼠身上起作用。”“可以想象，在患有焦虑症的人中，不同内部状态的神经元群之间存在不平衡。在精神疾病的动物模型中验证这一假说会很有趣。”

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