【Inscopix应用】Nature Communications：你看！你看！海马细胞偷偷在搬迁！

相信看到这个标题，小伙伴们也会和小编一样在脑海里面回荡起那个“你看，你看，月亮的脸偷偷的在改变~”吧。不过，今天小编不带大家去看改变的月亮，而是借助美国Inscopix公司的nVista自由活动钙成像方法去看看“搬迁的”齿状颗粒细胞（DGCs）~

海马神经元迁移视频

新生成的齿状颗粒细胞在大脑中并不是老老实实呆着的，它整合到神经环路时是一个动态的过程，对于这些新产生的神经元的初始发育以及这个阶段对于神经环路整合的意义，我们还所知甚少。纽约州立大学的Shaoyu Ge团队最近在《Nature Communications》发表了题为“Lateral dispersionis required for circuit integration of newly generated dentate granule cells”的文章，作者使用美国Inscopix公司的nVista自由活动钙成像方法，系统地分析了神经源区新生神经元的动态迁移，并观察了物理上相邻的细胞如何协调它们的横向迁移。相邻的新生神经元的全细胞记录显示，它们会通过缝隙连接耦合，当这种耦合被破坏时，新生细胞在神经源区的迁移就会受到限制了，这会严重影响随后的海马神经环路的整合。

Shaoyu Ge, PhD图片来源：stonybrookmedicine.edu

1. 新生成的DGCs迁移的实时成像

在成年大脑中已有的DGC层下面的神经源区不断产生新的DGCs。对基因和化学标记的新型DGCs的分析表明，它们在突触形成之前就在神经源区横向迁移。在本研究中，通过逆转录病毒编码绿色荧光蛋白(GFP)进行新生成的DGCs生成时间的测定。在转染5天后，当逆转录病毒标记的细胞具有DGC特征的有丝分裂后，我们观察到大多数GFP+ DGCs水平定位于GCL轴(图1a)。为了描述这些细胞沿神经源区扩散的时间，我们测量了GFP+ DGCs细胞轴相对于GCL轴在转染5、6和7天后所处的角度。我们发现，在此期间，- 10°和10°角之间的GFP+DGCs的百分比急剧下降(图1b)，表明沿神经源性区水平迁移可能发生在转染后5 – 7天之间。

为了评估新生成的DGCs沿神经源区扩散的动力学，作者利用显微内窥镜的实时成像方法来监测逆转录病毒标记的DGCs在自由活动小鼠脑内的分布。如图1c所示，注射GFP逆转录病毒2天后，自聚焦透镜(GRIN Lens)前端直接位于注射位点远端DGC层的正上方，焦平面位于亚颗粒区。恢复后3天，用显微内窥镜对自由活动的小鼠进行2天的GFP+细胞成像。大部分GFP+细胞在转染后5 – 6天之间广泛分布，大部分细胞向一个方向迁移，但也有一小部分细胞来回迁移。总的来说，检测到的GFP+细胞中大约有一半左右是横向分布的，另一半在成像过程中没有迁移或消失，可能是在背腹轴发生了凋亡或径向迁移。

作者进一步使用共聚焦显微镜观察了新生的DGCs（图1f），成像显示，大约一半的GFP+细胞沿神经原区水平分布，类似于在体内观察到的情况。另一半在成像过程中死亡。其结果与自由移动动物的测量结果一致(图1E)。

总而言之，通过逆转录病毒标记的DGCs的在体和离体成像显示，新产生的DGCs分散在转染后5-7天的神经原区。此外，作者发现物理上相邻的细胞的迁移以协调的跳跃方式发生，潜在地代表先前在吻侧迁移流中观察到的链扩散的单元。

图1 新生成的DGCs迁移的实时成像

2. 新生成的DGCs之间的电耦合

新生成的DGCs在神经源性区迁移过程中有相互作用，作者推测这些细胞可能是电偶联的，正如胚胎中观察到的径向迁移的皮质神经元那样。新生成的DGC之间的电耦合。因此，在转染后5天急性制备的厚度270μm海马切片中对物理上相邻的GFP+细胞进行全细胞记录，如图2a所示。将短暂的电流注入其中一个配对的细胞中，并且如前所述记录另一个细胞的具有稍小电流的响应(反之亦然)。对刺激表现出相互反应的两个细胞被定义为电耦合。如图2b，c所示，3/14对是耦合的，类似于皮质胚胎切片中迁移细胞的配对比率。电生理偶联时，通过灌流加入通用的连接蛋白阻断剂卡宾诺酮(100μM，图2d)时，可以观察到被阻断，表明偶联是通过缝隙连接进行的。

为了更有效地分析横向迁移，作者利用基于Cre-Loxp的双病毒系统稀疏地标记新生成的一群DGC并测量它们的扩散。暂时地，作者生成了表达GFP和dnCX43的依赖于cre的逆转录病毒载体(分别为flex-rgfp和flex-rdnCX43-gfp)，其中转基因序列是颠倒的。

将这些高滴度的逆转录病毒连同携带GFAP启动子下的Cre基因的慢病毒(Lenti-GFAP-Cre)注射到小鼠的齿状回区域以靶向新产生的DGC(图2e)，在祖细胞(Lenti-GFAP-Cre)中活性。

作者进一步通过FLEX-rGFP免疫染色证实新生的DGCs在这些转染5天后的簇中是未成熟的DGCs，如图2f所示。

在转染后5天记录了新生的DGC(图2g)。有趣的是，在转染5天后记录了三只小鼠的10对，发现5对是电耦合的(图2h)。与图2c中的观察一致，在转染7天后，在细胞簇中记录了7对，发现没有一对是耦合的(图2h)。这组实验表明，来自单个祖细胞的新生DGC可能会优先偶联。

图2 新生成的DGCs之间的电耦合

3. 横向迁移需要电耦合

为了评估通过缝隙连接的电耦合对于横向迁移的重要性，作者检查了连接蛋白43(Cx43)缺乏的细胞的神经源区迁移，Cx43是一种间隙连接通道蛋白，在神经干细胞及其齿状回的新生后代中高度表达。对于这些实验，Cx43-Floxed的动物被注射了Cre-GFP逆转录病毒，并且使用显微内窥镜方法在转染5天后对GFP+细胞成像(图3a)。美国Inscopix公司的nVista自由活动钙成像结果显示，神经源区内Cx43耗尽的GFP+细胞的迁移明显减少(图3b)。

由于缝隙连接介导电耦合和细胞-细胞粘附，作者接下来评估了电耦合而不是细胞粘附对于协调新产生的DGC的横向迁移是否重要，方法是使用偶联功能失调但粘附能力完整的负显性(DN)Cx43。为了更有效地分析横向扩散，利用图2e中描述的基于Cre-Loxp的双病毒系统，使用不同的时间线(图3c)稀疏地标记新生成的DGC的单个簇，并测量它们的离散度。在转染5天后，每只动物观察到约11-17簇新生成的GFP+ DGC(每簇2-5个细胞)(图3d)。

在转染FLEX-rGFP病毒的动物切片中，簇中最近的GFP+细胞之间的距离从转染5天后增加到7天后，但从7天到8天的距离很小(图3e，f)，相比之下，所分析的簇中dnCX43-GFP+细胞之间的距离在转染5到7天之间没有变化，表明横向迁移存在缺陷(图3g，h)。每个簇的dnCX43-GFP+细胞的数量在3到5个之间(平均3.2个细胞)，表明Cx43缺乏并没有改变在实验期间新产生的DGC的存活。

图3 横向迁移需要电耦合

4. 环路整合需要横向迁移

接下来，作者试图确定新生成的DGC在出生后的前2周内在其整合到现有神经网络中的横向迁移所起的作用。首先，测量在转染后7和14天表达dnCX43的新产生的DGC中树突的数量和长度(图4a)。GFP+细胞的分支数和树突总长度从转染后7天增加到14天，尽管程度比表达FLEX-rGFP病毒的对照细胞小(图4b)。为了确定形态的改变是否是由于发育延迟所致，记录了dnCX43+和对照GFP+ DGCs在转染5，7和14天时的膜特性。如图4c所示，这两组之间的膜特性没有明显差异。

作者在转染4天后诱导dnCX43在新生DGCs中的表达，并在转染14天时分析总支数和树突长度。与图4b中所示的发现一致，与在这些时间点仅表达GFP的细胞相比，dnCX43表达的诱导导致树突状细胞生长明显受抑(图4d)。这些细胞在转染14天时树突(即总分枝数和树突长度)的测量结果与对照组相当(图4e)。

然后，通过评估自发或诱发突触传递来测量新生DGC上的功能性突触形成。在转染4天诱导GFP或dnCX43的表达，并在转染21天进行实验，此时新生DGC功能整合良好。正如预期的那样，虽然这些dnCX43+细胞发展出正常的内在膜特性(图4f)，但它们具有严重的形态缺陷(图4g，h)。

对照组新生DGCs 100%记录到成功的突触传递，而dnCX43+DGCs仅有65±11.2%记录到成功的突触传递。在反应性dnCX43+DGC中，诱发兴奋性突触后电流（eEPSCs）的平均峰值振幅小于对照组(图4i)。对照组新生DGCs的自发谷氨酸能突触后电流(sEPSCs)频率为1.04±0.29 Hz，而dnCX43+DGCs为0.48±0.19 Hz。sEPSCs平均振幅无显著性差异(图4j)。

这些结果揭示了新产生的DGC在神经原区的横向迁移是随后的环路整合所必需的。

图4 环路整合需要横向迁移

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