[CELL文章]Inscopix钙成像揭示不同神经元类型和编码认知行为的关系

美国斯坦福大学的骆利群课题组于2020年12月17日在Cell上发表了题为“Differential encoding in prefrontal cortex projection neuron classes across cognitive tasks”的文章，在这项研究中，作者研究特定转录类型的小鼠PFC神经元与轴突投射和编码特性在多个认知任务中的关系，提出大多数神经元类型靶向多个靶点投射，且大多数靶点接受多种类型神经元的投射。通过使用滔博生物-Inscopix自由活动钙成像显微镜发现在自由活动的小鼠中进行“二选一”任务测试时，这些神经元中存在的任务相关信号的多样性。

图1 前额叶皮层投射神经元

摘要

    单细胞转录组学已被广泛应用于哺乳动物大脑中神经元的分类，而在早期的研究中，系统神经科学一直在没有考虑细胞类型的情况下分析皮质神经元的编码特性。研究人员对小鼠前额叶皮层（PFC）投影神经元的特定转录组类型如何与轴突投射和跨多个认知任务的编码特性相关展开研究。发现，除了PFC→PAG（导水管灰色）外，大多数类型的投射到多个目标，并且大多数目标都从多个类型投射。通过使用Inscopix自由行为纤维钙成像观察PFC→PAG投射类型的Ca 2+活性与自由活动小鼠“二选一”任务中的两种类型的比较，研究人员发现在所有检查的类中定性存在与任务相关的信号。但是，投射PAG的神经元在提示任务中编码选择，而对侧PFC投射的神经元在无提示任务中编码奖赏预测。因此，任务相关信号存在多样性，但是在具有特定分子解剖特征的细胞之间具有明显的定量偏差。

正文

    为了确定转录组类型并揭示PFC区域基因表达的潜在差异，研究人员分析了背内侧区（dmPFC）、腹内侧区（vmPFC）和眶额区（OFC）。首先，将Rbp4Cre与在Cre+细胞中表达tdTomato的小鼠杂交，双转基因后代从出生后第34天到第40天分离组织，并运用SMART-Seq2对tdTomato+细胞进行荧光激发细胞分类（FACS）和基于平板（plate-based）的scRNA-seq，共分析了来自三个区域的3139个细胞的。随后，用基于杂交链式反应的荧光原位杂交（HCR-FISH）检查了PFC转录组类型之间标记表达的空间位置和共标状况，发现dmPFC和vmPFC的转录组的空间相似，区分OFC的主要区别在于Pld5和Cxcr7（5-2）簇细胞的富集（图2）。

图2 Rbp4Cre标记的PFC投影神经元的转录组图

    为了研究vmPFC投射神经元的转录组类型与特定靶点之间的关系，研究人员对小鼠注射逆行Cre表达病毒，通过解剖含有逆行标记tdTomato+细胞的vmPFC并运行scRNA-seq后发现，大多数投射定义的细胞群体由多种转录组组成，且每个转录组类型共同投射到多个区域（图3）。例如，97%以上的vmPFC→PAG神经元映射到Npr3簇，虽然将这些群体称为“PAG投射”，但是，PAG并非特定靶点，即vmPFC→PAG神经元会将侧支延伸到多个皮质下靶点。紧接着，对PAG或cPFC投射的tdTomato+神经元进行切片染色，对上述部分观察结果进行验证。结果显示cPFC投射神经元与标记物Cd44、Cxcr7和Figf而不与Npr3共同标记，比例与测序数据中基本一致，相反的，PAG投射神经元与Npr3而非Figf高频率共同标记。因此，这部分研究分别通过转录组和投射信号分析了不同的神经元群体。

图3 vmPFC转录组类型

    接下来，研究人员对自由活动的小鼠实施“二选一（two-alternative forced choice, 2AFC）”任务，训练小鼠在中心端口区分两个气味提示，当移至正确端口时获取4μl水奖励，移至错误端口则会导致短暂的吹气处罚（图4）。通过Inscopix头戴式自由活动显微钙成像系统记录分析单个细胞水平的神经活动来探索不同的vmPFC细胞类型如何对决策制定的功能做出贡献（图5），并通过光遗传刺激皮层抑制神经元，使特定皮层区域沉默，测试vmPFC的神经活动对任务表现是否重要。研究人员在所有皮层GABA能抑制神经元中均表达ChR2的Gad2Cre；Ai32双转基因小鼠的vmPFC上方植入双侧光纤，结果显示vmPFC对于2AFC任务的正确执行是必需的。

图4 自由活动动物的2AFC任务

图5 二选一任务中对vmPFC进行Inscopix显微钙成像

    那么不同类型的vmPFC投射神经元如何编码任务相关信号呢？研究人员将上述试验任务定义为“Approach-Decision-Lick-Reward”四个阶段，通过在Cre依赖的GCaMP6f小鼠中使用自由活动显微钙成像记录以量化不同任务阶段所有成像细胞的比例（图5）。结果显示60%-80%的细胞都至少在一个阶段活性增高（图6），例如，在“Decision”阶段，与cPFC投射神经元相比，PAG投射神经元和Rbp4Cre标记的类别活化的细胞比例更高；相反，在“Reward”阶段，与Rbp4Cre相比，PAG和cPFC投射神经元活化的细胞比例较低。值得注意的是，许多vmPFC细胞不仅对任务阶段表现出活动选择性，而且对左或右的方向也有选择性，而对于方向选择性PAG投射神经元中包含大多数特定于选择方向的信息。

图6 细胞类别之间不同时间的活性差异

    研究人员在原有试验的基础上进行改动，小鼠需要正确辨别出四种可能气味来获取奖励，随后会切换到无气味提示任务，这也是本研究的关键特征，即对跨多个任务的行为编码的探究。发现PAG投射神经元主要表示编码气味提示任务中的选择性，但在切换到无提示任务时小鼠会花费数十秒迅速适应，而cPFC投射神经元则主要参与奖赏相关任务。这提示不同的细胞类型如何在不同的任务中发挥作用，并强调了在测试特定于细胞类型的编码时具有多样化的行为库的重要性。

    总的来说，这项工作通过scRNA-seq数据驱动对认知任务中编码特性的分析，弥合了分子和系统神经科学间的重要鸿沟，进一步加深对PFC功能的理解，并推断了任务信息如何在细胞类型框架中组织的原理。

参考文献:

Jan H. Lui, Liqun Luo, et al. Differential encoding in prefrontal cortex projection neuron classese across cognitive tasks. Cell(2020)